دادند. آناليزهاي کلي RT-PCR و ميکروآرايه را نيز جهت ارزيابي سطوح بيان 166cD و ژن هاي مربوطه در سلول هاي کشت شده انجام دادند . روش ايمونوهيستوشيمي بيان بالاي 166CD در بافت هاي سرطان لوزالمعده را در مقايسه با نمونه هاي کنترل لوزالمعده نرمال را نشان داد . سيتومتري جريان نشان داد که 166 CD در 2/70 -8/33 درصد سلول ها در بافت هاي جراحي شده لوزالمعده و 5/99-0 درصد رشته هاي سلولي سرطان لوزالمعده ظاهر شد . سلول هاي سرطاني لوزالمعده 166 CD مثبت شديدا تومورزا مي باشند،در حالي که سلول هاي سرطاني لوزالمعده 166CD منفي فعاليت هاي تهاجمي و جابجايي نسبتا قوي تري را نشان مي دهند . ( فوجي وارا30 و همکاران ،2014)
يکي از اهداف شيمي درماني رساندن داروها در دوزهاي مؤثر بصورتي ايمن و اثرگذار به جايگاه هاي وجود بيماري بدون تأثير بر بافت هاي سالم است. براي بهبود انتقال داروها امروزه از نانوتکنولوژي استفاده مي شود که عوارض جانبي را کاهش داده ، سمي شدن داروها را به حداقل مي رساند و راندمان درمان را بالا مي برد. با اين حال به دليل تنوع در ترکيبات کربوهيدراتي موجود در ساختمان آنتي بادي ها که مي تواند موجب سمي شدن آنتي بادي شده و خطر استفاده از چنين آنتي بادي هايي را بالا ببرد و همچنين به دليل اين که نيمه ، عمر اکثر آنتي بادي در سرم بسيار کوتاه است ، دانشمندان به فکر استفاده از عامل ديگري به جاي آنتي بادي ها افتادند. اپتامرهاي RNA اي جايگزين مناسبي به نظر مي رسيدند .
امتياز اين مولکول ها ، توليد ارزان تر و استحکام و ماندگاري بالاتر نسبت به آنتي بادي ها است .اين اپتامرها بعداز اتصال با پروتئين سطحي از طريق اندوسيتوز وارد سلول مي شوند ، بنابراين مي توانند به عنوان يک انتقال دهنده داروهاي شيمي درماني ، سم ها و راديوايزوتوپ هاي درماني به کار گرفته شوند ، اما اين اپتامرها قادر بودند پروتئين هاي سطحي شاخص سرطان را در مقياس خيلي کم را نيز شناسايي کنند. و بافت هاي طبيعي بدن را نيز مورد هدف قرار دهند . ( لي31 و همکاران ،2014) ميانگين سن ابتلا به سرطان طي سال هاي اخير روندي نزولي داشته است ؛ به طوري که سن متوسط بيماران در سال 1380 حدود 9/60 سال و در سال 1384 حدود 3/57 سال بوده است ؛ به طوري که بيشترين سرطان ها در گروه سني 75-70 سال مشاهده مي شود. ( محقق و همکاران ،2008) در سرطان کولورکتال افرادي که در زمان تشخيص بيماري ، دچار متاستاز تومور به ساير ارگان ها بوده اند ، خطر مرگ در آنها 4 برابر موارد عدم بروز متاستاز است. ( ژو32 و همکاران،2006 ،هان33 و همکاران ،2006)
بسياري از پژوهش نشان داده اند که نوعي همبستگي قوي ميان وسعت نفوذ تومور به ديواره روده و بقاء بيماران در سرطان کولورکتال وجود دارد. ( ايا34 و همکاران ،2003،هي35 و همکاران ،2002)

فصل سوم : مواد و روش ها
در انجام اين پايان نامه از عوامل زير استفاده کرديم :
3-1-1 باکتري مورد استفاده
در اين پايان نامه در مرحله کلونينگ ژن CD166 از باکتري E.coli سويه TOP10 و در مرحله ي ساب کلونينگ از باکتري E.coli سويه (DE3) BL21 استفاده شد . اين باکتري ها ابتدا بصورت ليوفيلزه بودند و براي استفاده از آن ، پودر باکتري را به 5 ميلي ليتر محيط کشت مايع LB اضافه کرديم و در دماي 37 درجه سانتي گراد به مدت يک شبانه روز کشت داده شدند.
3-1-2 پلاسميد
در مرحله ي ساب کلونينگ از پلاسميد بياني (pet-28a) که داراي پارامترهاي بيان کننده و همچنين جايگاه هاي برش آنزيمي دلخواه است استفاده کرديم. اين پلاسميد داراي جايگاه هاي مختلف براي انواع آنزيم هاي محدود کننده مي باشد که مي توان ژن موردنظر را به کمک آنها وارد پلاسميد کرد. همچنين داراي ژن مقاومت به آنتي بيوتيک کانامايسين است که به باکتري ترانسفورم شده امکان بقاء را در محيط حاوي کانامايسين مي دهد. جهت بيان قطعه ژن کلون شده در آن هم داراي پارامترهاي بياني مانند پروموتر lac مي باشد که در حضور القاگر IPTG شروع به بيان ژن موردنظر مي کند. در شکل 3-1 ، نقشه ژني پلاسميد pet-28a نشان داده شده است.
3-1-3 آنزيم ها
از آنزيم هاي محدودالاثر (Ncol) و (Xhol) که از شرکت فرمنتاز36 ليتواني تهيه شدند و از آنزيم اتصال دهنده T4 DNA Ligase هم در مرحله ي Ligation استفاده گرديد. اين آنزيم ها در شرايط دمايي 20 درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
3-1-4 کيت هاي آزمايشگاهي
کيت استخراج DNA از ژل و کيت استخراج پلاسميد از شرکت فرمنتاز ليتواني تهيه شدند و در شرايط دمايي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
3-1-5 آنتي بيوتيک ها
آنتي بيوتيک هاي آمپي سيلين و کانامايسين نيز با غلظت مناسب تهيه کرديم و در تيوب هاي 5/1 ميلي ليتري تقسيم گرديد و در شرايط دمايي 20 درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
3-1-6 محيط کشت باکتري
در اين مطالعه از محيط کشت هاي LB آگار و محيط کشت آگار جهت تکثير باکتري استفاده شد.
3-1-7 ژل الکتروفورز
پودر آگارز Low شرکت هيسپانلب37 تهيه شد و جهت ساختن ژل الکتروفورز مورد استفاده قرار گرفت.
3-1-8 مواد شيميايي
کليه مواد شيميايي از شرکت مرک آلمان با درجه ي خلوص بيولوژي مولکولي تهيه گرديد و در مراحل مختلف از جمله توليد ژل الکتروفورز (SDS-Page) مورد استفاده قرار گرفت.
3-1-9 وسايل و تجهيزات آزمايشگاهي
در انجام اين پايان نامه از وسايل و تجهيزات زير استفاده شد :
1. سمپلر در سايزهاي مختلف
2. نوک سمپلر آبي ، زرد ، کريستالي
3. ميکروتيوب هاي 2/0 ، 5/0 و 5/1
4. پليت يکبار مصرف 10 سانتيمتري
5. لوله ي آزمايش 160*16 سيماکس
6. اتوکلاو جهت ضدعفوني کردن وسايل پلاستيکي و محيط کشت ها
7. دستگاه فور جهت ضدعفوني کردن وسايل شيشه اي
8. انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوين (شکل 3-1)

شکل 3-1. انکوباتور
9. شيکرانکوباتور (شکل 3-2)

شکل 3-2. شيکر انکوباتور
10. تانک الکتروفورز افقي
11. تانک الکتروفورز (SDS-page)
12. دستگاه مولد ولتاژ (شکل 3-3)

شکل 3-3. تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ
13. گرماساز38
14. سانتريفيوژ ساخت شرکت اپندورف39 آلمان (شکل 3-4)

شکل 3-4. سانتريفيوژ اپندورف آلمان
15. بن ماري ساخت شرکت بهداد (شکل 5-3)

شکل 5-3. بن ماري
16. انکوباتور 16 درجه (شکل 3-6)

شکل 3-6. انکوباتور
17. دستگاه تصوير ساز ژل (شکل 3-7)

شکل 3-7. دستگاه تصوير ساز ژل
3-2 آناليز بيوانفورماتيکي پروتئين CD166
3-2-1 آناليز بيوانفورماتيکي
توالي موردنظر براي ژن موردنظر از طريق سايت هاي Swiss-port / Uniport KB و مرکز ملي اطلاعات بيوتکنولوژي (NCBI)40 بدست آورده شد.
سپس در انتهاي 3 توالي ، 6 اسيد آمينه ي هيستيدين (His-Tag) قرار داده شد و کدون پايان (TAA) هم بعد از آن قرار گرفت. در انتها نيز جايگاه هاي برش آنزيمي براي آنزيم هاي محدود کننده Ncol و BamHI در سر 5 توالي و جايگاه برش آنزيمي براي آنزيم محدود کننده Xhol در سر 3 توالي قرار داده شد.
3-2 بهينه سازي توالي يا Optimization
چون مولتي توپ طراحي شده فاقد هر گونه گيلکوليزاسيون بود ، ميزان پروکاريوتي E.Coli براي فرايند کلونينگ انتخاب شد. به منظور دسترسي به بيشترين ميزان بيان صحيح در ميزبان پروکاريوتي توالي 422 نوکلئوتيدي کايمر طراحي شده توسط شرکت Genscript ايالات متحده آمريکا بهينه سازي شد.
پارامترهايي که توسط اين شرکت براي فرايند بهينه سازي در نظر گرفته شد ، شامل موارد زير مي شود :
1. Codon usage ميزبان
2. محتواي CG
3. ساختار دوم mRNA پيش بيني شده
4. از بين بردن نواحي برش ناخواسته
5. جايگاه هاي آنزيمي آنزيم هاي محدودالاثر که ممکن است در فرايند کلونينگ اختلال ايجاد کنند.
6. به حداقل رساندن نواحي تکرار شونده مستقيم يا غيرمستقيم
3-3 سنتز شيميايي DNA موردنظر نوترکيب
3-3-1 سنتز شيميايي ژن نوترکيب
توالي ژن موردنظر توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شيميايي سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
3-3-2 پايداري و شرايط نگهداري DNA سنتز شده
DNA ليوفيليزه شده مي تواند توسط بافر TE استريل يا آب بدون نوکلئاز در PH طبيعي با توجه به امکانات محيط آزمايشگاه بصورت محلول دربيايد. بعد از محلول سازي مي توان آن را در دماي بين 20 تا 80 درجه سانتي گراد براي مدت طولاني نگهداري کرد. DNA ليوفيليزه شده ، محلول شده به کمک بافر TE مي تواند به مدت 6 ماه در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري شود در حالي که اگر از آب براي محلول سازي استفاده شود امکان نگهداري در 4 درجه سانتيگراد وجود ندارد.
3-3-3 محلول سازي DNA ليوفيليزه
قبل از باز کردن تيوب حاوي DNA ، ابتدا به مدت کوتاهي تيوب سانتريفيوژ شد تا DNA هاي متصل به ديواره جدا شوند. در صورت عدم سانتريفيوژ ممکن است مقداري از ذخيره ي DNA از دسترس خارج شود.
1. استوک اصلي : 10 ميکروگرم از DNA ليوفيليزه در 100 ميکروگرم از بافر TE حل شد.
2. استوک مورد استفاده : در يک ميکروتيوب ديگر 1 ميکروگرم از استوک اصلي در 10ميکروگرم از بافر TE حل شد. (غلظت نهايي به 10 رسيد).
3-4 کلونينگ پلاسميد AMP-pBSK حاوي DNACD166
جهت تکثير پلاسميد حاوي ژن CD166 مراحل زير طي شد :
3-4-1 آماده سازي باکتري شايسته
جهت آماده سازي باکتري Top 10 براي پذيرش پلاسميد ابتدا بايد آن را کامپتنت يا شايسته سازي ، براي پذيرش پلاسميد کرد.
3-4-1-1 مواد و محلول ها
– محلول کلريد کلسيم 1/0 مولار
– LB براث بدون آنتي بيوتيک
– LB براث حاوي آمپي سيلين (پس از ساخت براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن ، آمپي سيلين به محيط کشت افزوده شد. غلظت آمپي سيلين بايد حدود 100 ميکروگرم در هر ميلي ليتر باشد)
– LB آگار حاوي آمپي سيلين (روش تهيه دقيقا مشابه LB براث است)
3-4-1-2 روش کار
1. باکتري در محيط کشت فاقد آمپي سيلين کشت داده شد.
2. پس از 24 ساعت نگهداري در انکوباتور ، يک تک کلوني را انتخاب کرده و به 5 ميلي ليتر محيط LB مايع بدون آمپي سيلين تلقيح مي کنيم و سپس به مدت يک شب تا صبح در شکيرانکوباتور قرار مي دهيم تا باکتري رشد کنند.
3. يک ميلي ليتر از محيط فوق را به 5 ميلي ليتر محيط LB تازه تلقيح نموده و مجددا در شيکرانکوباتور قرار مي دهيم. 2 تا 3 ساعت بعد محيط کدورت مناسب يعني جذب 5/0 تا 8/0 در 500 نانومتر را به ما مي دهد.
4. باکتري هايي که به اين طريق تازه گشته و در فاز لگاريتمي تکثير مي باشند را در چند ميکروتيوب استريل توزيع کرده و 5 الي 10 دقيقه روي يخ نگه مي داريم.
5. ميکروتيوب ها را 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي کنيم.
6. مايع رويي را دور ريخته و رسوب باکتري را در يک ميلي ليتر محلول استريل 1/0 مولار کلريد کلسيم حل مي کنيم.
7. 20 تا 30 دقيقه محلول مذکور را روي يخ انکوبه مي کنيم.
8. اين بار رسوب را در 600 ميکروليتر محلول کلريد کلسيم استريل 1/0 مولار حل مي کنيم.
9. 20 تا 30 دقيقه محلول را روي يخ انکوبه مي کنيم.
10. سپس محلول را به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي کنيم.
11. رسوب را در 300 ميکروليتر محلول کلريد کلسيم استريل حل مي کنيم.
12. به مدت 20 دقيقه محلول را بر روي يخ قرار مي دهيم.
اين باکتري ها تا 72 ساعت روي يخ در يخچال قابل نگهداري مي باشند و مي توان با افزودن گليسرول استريل 30 درصد آنها را در 70- درجه سانتيگراد به مدت چند ماه نگهداري کرد.
3-4-2 ترانسفورماسيون پلاسميد به سلول هاي مستعد E.coli TOP10
بدين منظور از سويه E.coli TOP10 که يکي از رايج ترين سويه هاي کلونينگ است استفاده مي کنيم. اين باکتري به تنهايي حساس به آمپي سيلين است ولي وقتي وکتور را جذب کند نسبت به آنتي بيوتيک مقاوم شده و بر روي آگار

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید