قابل توجهي در مقاومت آن ايجاد نشود و افت شدت جريان مشاهده نشود قابل استفاده مي باشد.
7) بافر 2X SDS gel loading
اين بافر داراي SDS جهت باردار کردن نمونه ، مرکاپتواتانول جهت شکستن پيوندهاي دي سولفيدي ، گليسرول و تريس جهت سنگين کردن نمونه و پروموفنل پلو جهت رنگ آميزي و مشاهده حرکت نمونه در ژل مي باشد ، به صورت 2X تهيه شده و در هنگام استفاده به نسبت يک به يک با نمونه مورد بررسي ترکيب شده و به مدت 5 تا 10 دقيقه (به طور متوسط 7 دقيقه) در آب جوشانده شده يا در دماي 95 درجه سانتي گراد در هيت بلاک قرار مي گيرد.
8) بافر رنگ آميزي کوماسي بلو
کوماسي بلو يک رنگ آمينو تري آريل متان است ، که به صورت محکم اما نه به صورت کووالانسي به کمپلکس پروتئين ها از طريق ميان کنش هاي نيروهاي واندروالسي و الکترواستاتيک با گروه NH3+ متصل مي شود. محدوده شناسايي پروتئين ها با کوماسي بلو در حدود 3/0 الي 1 مي باشد. در اين روش پروتئين هاي جدا شده توسط ژل پلي آکريل اميد ، توسط يک محلول فيکس کننده که شامل متانول / استيک اسيد است ، رسوب داده مي شوند ، سپس محل پروتئين هاي رسوب داده شده توسط کوماسي بلو شناسايي مي شوند. بعد از رنگ بري باندهاي آب پروتئين ها نمايان مي شود.
براي تهيه اين بافر حجم محلول موجود در ظرف بافر را با آب مقطر به 300 ميلي ليتر برسانيد. اين بافر يکبار مصرف نيست و تا زمانيکه کيفيت رنگ آن کاهش نيافته است قابل استفاده مي باشد.
9) بافر رنگ برکوماسي بلو
از اين محلول براي رنگ زدايي کوماسي بلو از ژل پلي آکريل آميد استفاده مي شود. کوماسي بلو به طور اختصاصي به پروتئين ها متصل مي شود ولي به آساني از ژل پلي آکريل آميد جدا مي شود.
براي تهيه اين بافر حجم محلول موجود در ظرف بافر را با آب مقطر به 400 ميلي ليتر برسانيد.
10) TEMED
بعنوان کاتاليزور واکنش آکريل آميد و بيس آکريل آميد عمل مي کند.
3-6-2-3 روش انجام SDS-page :
1) اسلايدهاي شيشه اي مخصوص ساخت ژل را به خوبي شسته و در نهايتا براي حذف هر گونه آلودگي به اتانول تميز شود.
2) سپس اسلايدهاي شيشه اي در داخل سلول مخصوص خود قرار داده و براي اطمينان از عدم نشت ژل ، مقداري اتانول در اسلايدهاي شيشه اي ريخته ، به مدت 10 دقيقه در آن قرار گيرد. در صورت عدم نشت با احتياط ، اتانول واقع در اسلايدهاي شيشه اي دور ريخته شود.
3) بسته به وزن مولکولي پروتئين موردنظر بر اساس جدول 1 ، اقدام به ساخت ژل Running کنيد.
* ژل ساخته شده را در اسلايد شيشه اي ريخته تا حدي که 2 سانتي متر با سطح اسلايد فاصله داشته باشد. بلافاصله بعد از ريختن ژل ، بر روي سطح ژل ، ايزوپروپانول يا اتانول ريخته تا شرايط بي هوازي براي فعاليت TEMED فراهم شده و همچنين سطح ژل را صاف نمايد. براي اطمينان از بسته شدن ژل ، مقدار اضافي ژل را در يک لوله اپندورف ريخته و درب آن را محکم ببنديد.
* بلافاصله بعد از اضافه کردن TEMED ژل شروع به پليمريزه شده مي کند. بنابراين بايستي مواد به ترتيب از بالا به پايين اضافه شود و پس از اضافه کردن TEMED سريعا مخلوط و به فضاي بين دو اسلايد شيشه اي اضافه شود. در هنگام ريختن ژل بين اسلايدهاي شيشه اي از ايجاد حباب هوا بايستي جلوگيري شود.
4) وقتي که ژل در داخل لوله اپندورف پليمريزه شد (حدود 30 تا 60 دقيقه طول مي کشد) ، ژل Stacking بر اساس جدول 2 ساخته شده ، ايزوپروپانول را از سطح ژل دور ريخته و سپس ژل Stacking را تا سطح اسلايد اضافه و بلافاصله شانه تفلوني بر روي اسلايد قرار گيرد.
5) همانند مرحله 4 مقدار اضافي ژل را در يک لوله اپندورف ريخته و درب آن بسته مي شود (مدت زمان بسته شدن همانند مرحله 4)
6) وقتي که ژل بسته شد ، در تانک در حدود 1 ليتر بافر 1X Buffer Running Tank ريخته و اسلايدهاي شيشه اي را همراه با گيره آن درون تانک قرار دهيد. پس از اينکه بافر تانک سطح ژل را کاملا پوشاند به آرامي شانه را از ژل خارج نماييد.
7) در حين بستن ژل اقدام به آماده سازي نمونه ها شود به اين صورت که نمونه ها را با نسبت برابر با بافر بارگذاري مخلوط و به مدت 7 دقيقه جوشانده شود.
8) در چاهک نخست 5 ميکروليتر از مارکر پروتئين و در چاهک هاي بعدي ، بقيه نمونه ها ريخته شوند.
9) درب تانک را بسته سپس منبع تغذيه به تانک وصل گردد.
10) منبع تغذيه را در 60 ميلي آمپر تا زماني که نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running برسد ، تنظيم شود.
11) بعد از رسيدن نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running منبع تغذيه در 50 ميلي آمپر تا رسيدن نمونه ها به انتهاي ژل ، تنظيم شود.
3-6-2-4 رنگ آميزي کوماسي بلو :
1) پس از ران شدن نمونه ها بر روي ژل ، اسلايدهاي شيشه اي را به آرامي از ژل جدا کرده ، و يکي از ژل ها را به منظور رنگ آميزي با محلول کوماسي بلو در ظرف پلاستيکي با حدود ابعاد ژل قرار دهيد.
2) سطح ژل را با محلول کوماسي بلو پوشانده و به مدت 2 ساعت در دور آهسته بر روي شيکر قرار مي گيرد.
3) پس از اين مدت زمان محلول کوماسي بلو را دور ريخته و ژل را با آب شستشو دهيد تا رنگ هاي اضافي اوليه شسته شوند.
4) سپس سطح ژل را با مقداري محلول رنگ بر پوشانده و به مدت 2 ساعت در دور آهسته بر روي شيکر قرار مي گيرد.
5) در صورت نياز به رنگبري اضافي ، محلول رنگ بر دور ريخته شده ، سپس محلول رنگ بر تازه اضافه گردد. اين عمل تا زماني که باندهاي آبي نمايان شود و ژل دوباره شفاف شود ، ادامه داده مي شود.
براي نگه داري ژل مي توان از محلول استيک اسيد 7% استفاده نمود.

فصل چهارم : نتايج
4-1 نتايج حاصل از بهينه سازي توالي يا Optimization
در توالي نوكلئوتيدي اوليه پارامترهايي وجود داشت كه كارايي سيستم بياني در ميزبان E.Coli را پايين مي آورد. در نتيجه اين پارامترها با جايگزيني نوكلئوتيدهاي مناسب و ايجاد كدون هايي با راندمان بالا بهينه سازي شد. در تغييرات ايجاد نكات زير مورد توجه قرار گرفت :
– هيچ اسيد آمينه اي تغيير نكند.
– قالب خواندني50 در ژن نهايي تغيير نكند.
– كدون هايي انتخاب شود كه بيشترين بيان را در ميزبان داشته باشد.
– پايداري mRNA مورد بررسي و توجه قرار گيرد.
– جايگاه هاي آنزيم محدود كننده در دو سر توالي بدون تغيير بماند.
پارامترهايي كه طي بهينه سازي دستخوش تغيير قرار گرفتند به شرح زير مي باشد :
1) شاخص سازگاري كدون51 يا (CAI) :
از لحاظ كمي مقدار تمايل كدون ، كدون هاي مترادف با استفاده از شاخص سازگاري كدوني يا CAI اندازه گيري مي شود كه بين صفر تا يك متغير است. زماني كه شاخص برابر صفر باشد به اين معناست كه همه كدون هاي مترادف به يك ميزان در يك ژن استفاده شده اند و مقدار برابر يك به معناي حداكثر بودن ميزان تمايل كدوني بوده و در اين مورد فقط كدون هاي بهينه مورد استفاده قرار گرفته اند كه بالطبع آن نشان دهنده بيان بيشتر و دائم يك ژن و به عبارتي تعيين كننده سطح بيان آن خواهد بود. با توجه به اين پارامتر ميزان CAI برابر با يك ، بهترين حالت بياني ممكن و بيشتر از 8/0 ، حالت بياني خوب و 6/0 ، حالت بياني متوسط را دارا خواهند بود. در توالي اوليه طراحي شده ميزان CAI برابر با 69/0 بود كه با تغييرات نوكلئوتيدي اعمال شده اين ميزان به 88/0 تغيير يافت. (شكل 4-1)
شكل 4-1. شاخص سازگاري كدون. سمت راست : قبل از بهينه سازي ، سمت چپ : بعد از بهينه سازي
بدين ترتيب ميزان فراواني كدون هاي بهينه52 (FOP) نيز افزايش يافت به صورتي كه كدون هاي كاملا اپتيموم براي توالي امينواسيدي در نظر گرفته شده از 43% در توالي اوليه به 70% در توالي بهينه شده افزايش يافتند. ديگر كدون ها هم در بهترين حاليت كه در توالي مي توانستند حضور يابند به صورت بهينه درآمدند.
FOP اپتيموم نشان گر بيان كاملا دقيق كدون هاي كد كننده امينواسيدها هستند ، بدين معني كه با توجه به ميزان تغييراتي كه در كل توالي مي تواند صورت گيرد ، براي يك امينواسيد خاص ، اين كدون در ميزبان بالاترين راندمان بياني را مي تواند داشته باشد (شكل 4-2)
شكل 4-2. ميزان فراواني كدون هاي بهينه. سمت چپ : قبل از بهينه سازي ، سمت راست : بعد از بهينه سازي
2) شاخص محتواي G-C
ميانگين محتواي G-C يك توالي مناسب بين 30% تا 70% (بطور ميانگين 50%) مي باشد. شاخص محتواي G-C توالي اوليه از ميزان 59/41% به 56/48% در توالي بهينه سازي شده افزايش يافت كه اين امر سبب افزايش نيمه عمر mRNA ژن موردنظر مي شود (شكل 4-3)
شكل 4-3. شاخص محتواي G-C. سمت راست : قبل از بهينه سازي ، سمت چپ : بعد از بهينه سازي
با توجه به پارامترهاي تغيير يافته ، توالي 1463 نوكلئوتيدي نهايي براي ژن CD166 در شكل 4-4 نشان داده شده است. همچنين در شكل 4-5 نيز توالي اوليه و توالي بهينه سازي شده را بطور مقايسه اي و نوكلئوتيد به نوكلئوتيد مي توان مشاهده كرد.
شكل 4-4. ترادف مولتي توپ ژني موردنظر پس از بهينه سازي كدون هاي مربوطه جهت بيان در ميزبان E.coli
شكل 4-5. مقايسه نوكلئوتيد بصورت نظير به نظير در توالي هاي اوليه و بهينه سازي شده.
4-2 سنتز شيميايي DNA موردنظر نوتركيب
توالي ژن موردنظر توسط شركت Biomatik كانادا بصورت شيميايي سنتز شد و درون وكتور pBSK قرار داده شد. اين وكتور قبلا به نام pBMH شناخته مي شد كه طولي برابر با 2907bp دارد. اين وكتور داراي ژن مقاومت به آنتي بيوتيك آمپي سيلين مي باشد كه مي توان از آن براي جداسازي كلوني هاي نوتركيب استفاده كرد. طول توالي بعد از سنتز ژن به داخل پلاسميد به 4370 bp رسيد. توالي سنتز شده تمام مراحل كنتري كيفيت را با موفقيت گذراند. از جمله اين مراحل مي توان به موارد زير اشاره كرد.
تائيد صحت توالي ژن نوتركيب
تائيد صحت توالي پلاسميد حامل
تائيد صحت شكل خواندن (Reading Frame) در فرايند رونويسي
تائيد اندازه ژن سنتز شده به كمك هضم آنزيمي (شكل 4-6)

Gene name:CD166 ext
Clone ID#:D5913-2
RES: HindIII
Construct map:
شكل 4-6. تائيد اندازه ژن سنتز شده به كمك هضم آنزيمي
تاييد سحت قابليت تكثير ژن به كمك تكنيك PCR و عدم وجود هر گونه آلودگي در آن
كيفيت مناسب DNA سنتز شده به كمك تكنيك اسپكتروسكوپي53
و عدم وجود هر گونه آلودگي در آن
شكل ظاهري شفاف و عدم وجود هر گونه ذره ي خارجي در آن
سفارش مذكور به شكل پودر ليوفيليزه و در حجم 10 ميكروگرم دريافت شد و سپس بصورت استوك قابل استفاده با توجه به دستورالعمل شركت سازنده درآمد. نقشه ي ژني پلاسميد حاوي DNA نوتركيب CD166 در شكل 4-7 نمايش داده شده است. در اين شكل جايگاه ژن موردنظر ، نحوه قرارگيري آن در پلاسميد حامل ، جايگاه آنزيم هاي محدود كننده و همچنين جايگاه ژن مقاومت به آنتي بيوتيك آمپي سيلين نشان داده شده است

شكل 4-7. نقشه ي ژني پلاسميد حاوي DNA نوتركيب CD166
4-3 كلونينگ پلاسميد AMP-pBSK حاوي DNACD166
جهت تكثير پلاسميد حاوي ژن سنتز شده ارسال شده توسط شركت توليدي ، فرايند ترانسفورميشن براي باكتري هاي كامپتنت E.coli سويه Top 10 انجام شد و از كلوني هاي رشد كرده در محيط داراي آنتي بيوتيك آمپي سيلين ، تك كلوني انتخاب شد و سپس از تك كلوني هاي انتخاب شده به روش ليز قليايي استخراج پلاسميد صورت گرفت. جهت تائيد حضور پلاسميد در محلول بدست آمده ، الكتروفورز انجام شد. با پديدار گشتن باند 4366 bp در ژل ، حضور پلاسميد حاوي ژن CD166 محرز گشت. در شكل 4-7 ، نتيجه حاصل از الكتروفورز محصول استخراج پلاسميد نشان داده شده است.

شكل 4-7. تائيد حضور پلاسميد حاوي ژن CD166 در محصول استخراج پلاسميد- از سمت راست چاهک اول نمونه پلاسميد حاوي ناحيه مورد نظر و چاهک دوم لدر DNA1kb-پيکان

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید