ما مي دهد.
4- باكتري هايي كه به اين طريق تازه گشته و در فاز لگاريتمي تكثير مي باشند را در چند ميكروتيوب استريل توزيع كرده و 5 الي 10 دقيقه روي يخ نگه مي داريم.
5- ميكروتيوب ها را 3 دقيقه در 900 دور سانتريفيوژ مي كنيم.
6- مايع روئي را دور ريخته و رسوب باكتري را در يك ميلي ليتر محلول استريل 1/0 مولار كلريد كلسيم حل مي كنيم.
7- 20 تا 30 دقيقه محلول مذكور را روي يخ انكوبه مي كنيم.
8- اين بار رسوب را در 600 ميكروليتر محلول كلريد كلسيم استريل 1/0 مولار حل مي كنيم.
9- 20 تا 30 دقيقه محلول را روي يخ انكوبه مي كنيم.
10- سپس محلول را به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي كنيم.
11- رسوب را در 300 ميكروليتر محلول كلريد كلسيم استريل حل مي كنيم.
12- به مدت 20 دقيقه محلول را بر روي يخ قرار مي دهيم.
اين باكتري ها تا 72 ساعت روي يخ رد يخچال قابل نگهداري مي باشند و مي توان با افزودن گليرول استريل 30 درصد آنها را در 70- درجه سانتيگراد به مدت چند ماه نگهداري كرد.
3-5-3-2 ترانسفورماسيون سلول هاي شايسته E.coli BL21(DE3) با محصول لايگيشن به روش شوك حرارتي
مراحل انجام كار به صورت زير است :
1- ابتدا 100 ميكروليتر از سلول هاي مستعد E.coli BL21(DE3) را روي يخ ذوب مي كنيم.
2- 30 ميكروليتر از محصول لايگيشن را به 100 ميكروليتر از سلول هاي مستعد اضافه مي كنيم به طوري كه كاملا با هم مخلوط شوند.
3- اين مخلوط را به مدت 30 دقيقه بر روي يخ انكوبه مي كنيم.
4- نمونه ها را به مدت 90 ثانيه در بن ماري 42 درجه سانتيگراد قرار مي دهيم و بلافاصله به روي يخ منتقل مي كنيم و 5 دقيقه اجازه مي دهيم بدون حركت روي يخ بماند.
5- مخلوط فوق را به 900 ميكروليتر از محيط LB فاقد كانامايسين افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شيكرانكوباتور 37 درجه قرار مي دهيم تا باكتري هاي ترانسفورم شده بتواند شروع به تكثير نمايند.
6- مخلوط فوق را به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي كنيم.
7- 800 ميكروليتر از مايع روئي را دور ريخته و رسوب را در 230 ميكروليتر باقي مانده ، به خوبي حل مي كنيم.
8- 230 ميكروليتر را روي يك پليت حاوي LB آگار كانامايسين دار ريخته و كشت سه قسمتي مي دهيم ، اجازه مي دهيم كاملا جذب محيط شده و سپس آنها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انكوباتور 37 درجه نگهداري مي كنيم.
3-5-4 ارزيابي كلوني ها
پس از انكوباسيون در 37 درجه سانتيگراد اندازه كلوني ها به حدود 1 تا 2 ميلي متر مي رسد. يك تك كلوني را جدا كرده و در 5 ميلي متر LB براث كانامايسين دار تلقيح مي نمائيم و به مدت يك شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شيكر انكوبه مي نمائيم. با رشد باكتري در اين محيط تاييد مي شود كه باكتري BL21(DE3) پلاسميد بياني pet-28a حاوي ژن ما را دريافت كرده است.
3-5-5 استخراج پلاسميد بياني pet-28a حاوي ژن CD166
جهت تاييد وجود پلاسميد بياني pet-28a در باكتري و عدم وجود هر گونه آلودگي در محيط كشت نياز است كه وجود پلاسميد موردنظر تاييد شود ، بدين منظور از محيط كشت حاوي باكتري ترانسفورم شده BL21(DE3) استخراج پلاسميد صورت گرفت. مراحل انجام كار به صورت زير است :
1- از محيط كشت حاوي باكتري ترانسفورم شده كه به مدت يك شبانه روز در دماي 37 درجه انكوبه شده است و كاملا بصورت كدر درآمده است ، 5/1 ميلي ليتر جدا كرده و داخل ميكروتيوب 5/1 مي ريزيم.
2- سپس به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي كنيم.
3- محيط روئي را دور ريخته و باكتري در ته ميكروتيوب رسوب مي كند.
نكته : براي استخراج غلظت بالاتري از پلاسميد مي توان مراحل قبل را تكرار كرد.
4- در اين مرحله 250 ميكروليتر از بافر محلول كننده كه داراي RNAase است به رسوب باكتري اضافه كرده و مخلوط را كاملا هم مي زنيم تا رسوبي در ته ميكروتيوب باقي نماند و تمامي آن در حلال حل شود.
5- 250 ميكروليتر از محلول ليز كننده به مخلوط اضافه مي كنيم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته مي كنيم تا كاملا مخلوط شود. اين بافر كاملا باكتري را ليز مي كند.
6- در مرحله ي بعد 350 ميكروليتر از بافر خنثي كننده به مخلوط مرحله قبل اضافه مي كنيم. سپس سريعا ميكروتيوب را چند بار سروته مي كنيم تا باكتري هاي ليز شده به حالت ابري شكل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقيقه در 9000 دور محلول را سانتريفيوژ كرده تا قطعات باكتري رسوب كنند.
8- محلول روئي را نگه داشته و رسوب را دور مي ريزيم.
9- محلول روئي به ستون استخراج پلاسميد منتقل مي كنيم. اين ستون حاوي سيليكا است كه پلاسميد را جذب مي كند.
10- ستون حاوي محلول را به مدت 1 دقيقه در 12000 دور سانتريفيوژ مي كنيم.
11- محلول روئي را دور مي ريزيم.
12- به ستون 500 ميكروليتر بافر شستشو اضافه مي كنيم.
13- به مدت 45 ثانيه در 12000 دور ستون را سانتريفيوژ مي كنيم.
14- مرحله قبل را يكبار ديگر تكرار مي كنيم.
15- محلول درون ستون را دور مي ريزيم.
16- ستون را به مدت 1 دقيقه ديگر در 12000 دور سانتريفيوژ مي كنيم تا الكل موجود در بافر شستشو كه در مرحله ي قبل مورد استفاده قرار گرفت كاملا از ستون خارج شود زير الكل مانع واكنش هاي آنزيمي مي باشد.
17- ستون را درون يك ميكروتيوب 5/1 قرار مي دهيم و سپس بافر جداكننده را به ميزان 50 ميكروليتر به ستون اضافه مي كنيم. بافر جدا كننده دقيقا بايد بر روي سيليكا ريخته شود. 2 الي 3 دقيقه در دماي اتاق ستون را نگه مي داريم تا بافر كاملا به سيليكا نفوذ كند.
18- به مدت 2 دقيقه در 12000 دور ستون را در درون ميكروتيوب 5/1 سانتريفيوژ مي كنيم.
19- ستون را دور ريخته و محلول درون ميكروتيوب حاوي پلاسميد استخراج شده است.
3-5-6 تاييد انزيمي پلاسميد استخراج شده
بعد از استخراج پلاسميد pet-28a كه حاوي ژن CD166 انتقال داده شده به آن به كمك تكنيك لايگيشن است و تاييد وجود آن ، با توجه به جايگاههاي آنزيمي در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهاي ژن CD166 مي توان از آنها جهت تاييد حضور ژن در پلاسميد استفاده كرد و سپس محصول هضم آنزيمي دوگانه جهت بررسي بر روي ژل آگارز بوده تا قطعات موردنظر مربوط به پلاسميد و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-5-6-1 هضم آنزيمي دوگانه و الكتروفورز
مراحل انجام كار به شكل زير است :
1- يك ميكروتيوب 2/0 برمي داريم و محتويات واكنش را به صورت زير در آن مخلوط مي كنيم.
* آب استريل : 12 ميكروليتر
* بافر تنگو 2x : 4 ميكروليتر
* آنزيم Ncol : 1 ميكروليتر
* آنزيم Xhol : 1 ميكروليتر
* پلاسميد pet-28a نوتركيب : 2 ميكروليتر
حجم نهايي واكنش : 20 ميكروليتر
2- ميكروتيوب را به مدت 1 الي 2 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتيگراد (دماي اپمتيوم واكنش آنزيم ها) قرار مي دهيم.
3- الكتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسميد و ژن CD166 شناسايي و تاييد شوند.
3-6 بيان پروتئين CD 166
پس از تاييد ترانسفورماسيون و وجود پلاسميد حاوي ژن CD166 در باكتري ميزبان ، با توجه به پروموتر lac در پلاسميد pet-28a ، جهت القاء بيان پروتئين در باكتري از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد.
3-6-1 القاء بيان پروتئين به كمك IPTG
مراحل كار بصورت زير مي باشد :
1) به 2 ميلي ليتر از محيط كشت LB حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين ، 20 لاندا از باكتري BL21(DE3) ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت يك شب در شيكرانكوباتور 37 درجه سانتيگراد و با سرعت rpm 150 قرار داده شد و به آن اجازه داديم تا رشد كند.
2) 20 لاندا از مخلوط موردنظر به 2 ميلي ليتر از محيط كشت LB تازه حاوي انتي بيوتيك كانامايسين اضافه شد و به مدت 2 ساعت در شيكرانكوباتور 37 درجه سانتيگراد با rpm 150 قرار داده شد تا غلظت باكتري موردنظر به OD به 8/0 برسد. بدين طريق باكتري ها تازه گشته و در فاز لگاريتمي خود قرار دارند.
3) 20 لاندا از القاگر IPTG با غلظت 100 ميكروگرم در ميلي ليتر به 2 ميلي ليتر از محيط كشت حاوي باكتري ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت 6 ساعت در شيكرانكوباتور 37 درجه سانتيگراد با سرعت rpm 150 قرار داده شد.
نكته : نمونه هاي كنترل منفي بدون افزوده شدن IPTG مورد بررسي قرار گرفتند.
4) مخلوط موردنظر به مدت 5 دقيقه در 4 درجه و با سرعت rpm 5000 سانتريفيوژ شد.
5) محلول روئي را دور ريخته و به رسوب آن لاندا 60 اوره 8 مولار اضافه شد و به كمك تكنيك SDS-page بيان پروتئين موردنظر مورد بررسي قرار گرفت.
6-3-2 بررسي بيان به كمك تكنيك SDS-page
به منظور جداسازي باندهاي پروتئيني سلولي و ردگيري پروتئين نوتركيب در سلول هاي ترانسفورم شده و نيز ميزان بيان پروتئين موردنظر از الكتروفورز بر روي ژل پلي اكريل اميد استفاده شد و عصاره هاي سلولي تهيه شده بر روي SDS-page الكتروفورز شدند. با توجه به اين كه وزن مولكولي پروتئين نوتركيب حدود 5/53 كيلو دالتون مي باشد از ژل 12% استفاده شد. براي بررسي بيان پروتئين نوتركيب از كيت 8D8-page ساخت شركت سيتومتين ژن اصفهان استفاده شد.
3-6-2-1 محتويات كيت 8D8-page
1. محلول ذخيره آکريل اميد و بيس آکريل اميد 40% : 40 ميلي ليتر
2. محلول بافر Running 10X : 25 ميلي ليتر
3. محلول بافر Stacking 10X : 10 ميلي ليتر
4. پودر محلول ذخيره SDS 10% : 5 ميلي ليتر
5. پودر محلول 10% آمونيوم پرسولفات (APS) : 5 ميلي ليتر
6. پودر بافر Tank 10X : 400 ميلي ليتر
7. محلول بافر 2X SDS gel loading : 2 ميلي ليتر
8. محلول رنگ آميزي کوماسي بلو : 300 ميلي ليتر
9. محلول رنگ بر کوماسي بلو : 400 ميلي ليتر
10. محلول TEMED : 1 ميلي ليتر
مواردي که موردنياز است ولي در کيت موجود نيست : اتانول ، مارکر پروتئين
3-6-2-2 آماده سازي و توضيحات مربوط به محتويات کيت :
1) آکريل اميد 40%
اين محلول بايد در ظرف تيره و در دماي اتاق نگه داري شود زيرا نور و شرايط قليايي باعث تسريع واکنش تبديل آکريل اميد و بيس آکريل اميد به آکريليک اسيد و بيس آکريليک اسيد مي شود.
2) بافر Running 10X
از اين بافر براي تهيه ژل Running استفاده مي شود.
3) بافر Stacking 10X
از اين بافر براي تهيه ژل Stacking استفاده مي شود. نکته مهم در مورد دو بافر شماره دو و سه اسيديته آنهاست . در صورتيکه مدت زمان زيادي از زمان تهيه ي اين بافرها گذشته باشد کيفيت و کارايي ژل در تفکيک پروتئين به شدت کاهش مي يابد.
4) محلول ذخيره SDS 10%
براي تهيه محلول ذخيره SDS 10% ، پودر SDS موجود در بطري شماره 4 را در 5 ميلي ليتر آب مقطر استريل گرم حل و سپس در دماي اتاق نگه داري شود.
5) محلول 10% آمونيوم پرسولفات (APS)
آمونيوم پر سولفات راديکال هاي آزاد را براي پليمريزاسيون آکريل اميد و بيس آکريل اميد فراهم مي نمايد و نقش بسيار مهمي در بسته شدن ژل دارد.
اين محلول بهتر است براي هر بار تهيه ي ژل به صورت تازه تهيه شود. براي تهيه اين محلول ، 05/0 گرم پودر APS در 500 ميکروليتر آب مقطر استريل حل شود. محلول ساخته شده را مي توان در دماي 4 درجه سانتي گراد نگه داري نمود.
6) بافر Tank 10 X
از اين بافر براي هدايت جريان الکتريسيته در ژل استفاده مي شود. براي تهيه اين بافر ، پودر محتوي شيشه شماره 6 را در 320 ميلي ليتر آب مقطر حل کرده ، توسط اسيد کلريدريک PH آن را در 5/8 تنظيم و سپس حجم نهايي آن را به 400 ميلي ليتر برسانيد. بافر تهيه شده در اين مرحله به صورت 10 X مي باشد و بنابراين براي استفاده بايستي آن را به نسبت 1 به 10 با آب مقطر رقيق نمود.
* دقت شود که قبل از تنظيم PH پودر موجود به طور کامل حل شود.
* PH اين بافر در الگوي حرکت پروتئين ها و صحت روند آزمايش بسيار مهم مي باشد پس دقت شود که دقيق تنظيم شود.
* بافر 1x تهيه شده يکبار مصرف نمي باشد و تا زماني که تغيير

دسته‌ها: No category

دیدگاهتان را بنویسید