حاوي آمپي سيلين تشکيل کلوني مي دهد.
3-4-2-1 روش کار :
مراحل کار به ترتيب زير است :
1. 50 ميکروليتر سوسپانسيون سلولي شايسته را ابتدا روي يخ ذوب مي کنيم.
2. 2 ميکروليتر از پلاسميد AMP-pBSK حاوي DNACD166 را به آن اضافه مي کنيم.
3. اين مخلوط را به مدت 30 دقيقه روي يخ انکوبه مي کنيم.
4. نمونه ها را به مدت 90 ثانيه در بن ماري 42 درجه سانتيگراد قرار مي دهيم و بلافاصله به روي يخ منتقل مي کنيم و 5 دقيقه اجازه مي دهيم بدون حرکت روي يخ بماند.
5. مخلوط فوق را به 900 ميکروليتر از محيط LB فاقد آمپي سيلين افزوده و آن را به مدت 5/1 ساعت در شيکر انکوباتور 37 درجه قرار مي دهيم تا باکتري هاي ترانسفورم شده بتواند شروع به تکثير نمايند.
6. مخلوط فوق را به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي کنيم.
7. 700 ميکروليتر از مايع رويي را دور ريخته و رسوب را در 250 ميکروليتر باقي مانده خوب حل مي کنيم.
8. 100 ميکروليتر را روي يک پليت LB آگار و 150 ميکروليتر را روي يک پليت ديگر داراي LB آگار آمپي سيلين دار ريخته و کشت سه قسمتي مي دهيم ، اجازه مي دهيم کاملا جذب محيط شده و سپس آن ها را به مدت 18 تا 20 ساعت در انکوباتور 37 درجه نگهداري مي کنيم.
3-4-3 ارزيابي کلوني ها
پس از انکوباسيون در 37 درجه سانتيگراد اندازه کلوني ها به حدود 1 تا 2 ميلي متر مي رسد. يک تک کلوني را جدا کرده و در 5 ميلي ليتر LB براث آمپي سيلين دار تلقيح مي نمائيم و به مدت يک شب در 37 درجه و با سرعت مناسب شيکر انکوبه مي نمائيم. با رشد باکتري در اين محيط تاييد مي شود که باکتري ، پلاسميد حاوي ژن ما را دريافت کرده است.
3-4-4 استخراج پلاسميدAMP-pBSK حاوي DNACD166
اساس استخراج پلاسميد مبتني بر ليز قليايي و متعاقب آن جذب DNA توسط سيليکا41 و سپس جداسازي پلاسميد از ستون مي باشد. براي استخراج پلاسميد از کيت تهيه شده از شرکت فرمنتاز ليتواني استفاده شد (شکل 3-8).
شکل 3-8. کيت استخراج پلاسميد فرمنتاز
روش کار :
1- از محيط کشت حاوي باکتري ترانسفورم شده که به مدت يک شبانه روز در دماي 37 درجه انکوبه شده است و کاملا بصورت کدر درآمده است ، 5/1 ميلي ليتر جدا کرده و داخل ميکروتيوب 5/1 مي ريزيم.
2- سپس به مدت 3 دقيقه در 9000 دور سانتريفيوژ مي کنيم.
3- محيط روئي را دور ريخته و باکتري در ته ميکروتيوب رسوب مي کند.
نکته : براي استخراج غلظت بالاتري از پلاسميد مي توان مراحل قبل را تکرار کرد.
4- در اين مرحله 250 ميکروليتر از بافر محلول کننده42 که داراي RNAase است به رسوب باکتري اضافه کرده و مخلوط را کاملا هم مي زنيم تا رسوبي در ته ميکروتيوب باقي نماند و تمامي آن در حلال حل شود.
5- 250 ميکروليتر از محلول ليزکننده43 به مخلوط اضافه مي کنيم سپس آن را 4 تا 6 بار سروته مي کنيم تا کاملا مخلوط شود. اين بافر کاملا باکتري را ليز مي کند.
6- در مرحله ي بعد 350 ميکروليتر از بافر خنثي کننده44 به مخلوط مرحله قبل اضافه مي کنيم. سپس سريعا ميکروتيوب را چند بار سروته مي کنيم تا باکتري هاي ليز شده به حالت ابري شکل لخته شوند.
7- سپس به مدت 5 دقيقه در 9000 دور محلول را سانتريفيوژ کرده تا قطعات باکتري رسوب کنند.
8- محلول روئي را نگه داشته و رسوب را دور مي ريزيم.
9- محلول رويي به ستون استخراج پلاسميد منتقل مي کنيم. اين ستون حاوي سيليکا است که پلاسميد را جذب مي کند.
10- ستون حاوي محلول را به مدت 1 دقيقه در 12000 دور سانتريفيوژ مي کنيم.
11- محلول روئي را دور مي ريزيم.
12- به ستون 500 ميکروليتر بافر شستشو45 اضافه مي کنيم.
13- به مدت 45 ثانيه در 12000 دور ستون را سانتريفيوژ مي کنيم.
14- مرحله قبل را يکبار ديگر تکرار مي کنيم.
15- محلول درون ستون را دور مي ريزيم.
16- ستون را به مدت 1 دقيقه ديگر در 12000 دور سانتريفيوژ مي کنيم تا الکل موجود در بافر شستشو که در مرحله ي قبل مورد استفاده قرار گرفت کاملا از ستون خارج شود زيرا الکل مانع واکنش هاي آنزيمي مي باشد.
17- ستون را درون يک ميکروتيوب 5/1 قرار مي دهيم و سپس بافر جدا کننده46 را به ميزان 50 ميکروليتر به ستون اضافه مي کنيم. بافر جدا کننده دقيقا بايد بر روي سيليکا ريخته شود. 2 الي 3 دقيقه در دماي اتاق ستون را نگه مي داريم تا بافر کاملا به سيليکا نفوذ کند.
18- به مدت 2 دقيقه در 12000 دور ستون را در درون ميکروتيوب 5/1 سانتريفيوژ مي کنيم.
19- ستون را دور ريخته و محلول درون ميکروتيوب حاوي پلاسميد استخراج شده است.
3-4-5 تاييد آنزيمي پلاسميد استخراج شده
بعد از استخراج پلاسميد AMP-pBSK که حاوي ژن CD166 سنتز شده توسط کمپاني مي باشد ، با توجه به جايگاه هاي آنزيمي در نظر گرفته شده در ابتدا و انتهاي ژن سنتز شده مي توان از آن ها جهت تاييد حضور ژن در پلاسميد استفاده کرد و سپس محصول هضم آنزيمي دوگانه47 جهت بررسي بر روي ژل آگارز بوده تا قطعات موردنظر مربوط به پلاسميد و ژن سنتز شده مشاهده شوند.
3-4-5-1 هضم آنزيمي دوگانه يا Double digestion
1- ابتدا بافر مناسب براي هضم دوگانه آنزيم هاي Ncol و Xhol را به كمك سايت شركت توليد كننده يعني فرمنتاز ليتواني انتخاب مي كنيم. بهترين شرايط بافري براي اين واكنش بافر 2x تنگو مي باشد.
2- يك ميكروتيوب 2/0 برمي داريم و محتويات واكنش را به صورت زير در آن مخلوط مي كنيم.
* آب استريل : 12 ميكروليتر
* بافر تنگو 2x : 4 ميكروليتر
* آنزيم Ncol : 1 ميكروليتر
* آنزيم Xhol : 1 ميكروليتر
* پلاسميد : 2 ميكروليتر
حجم نهايي واكنش : 2 ميكروليتر
3- ميكروتيوب را به مدت 1 الي 2 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتيگراد (دماي اپمتيوم واكنش آنزيم ها) قرار مي دهيم.
3-4-5-2 الكتروفورز
جهت جداسازي قطعات حاصل از هضم دوگانه آنزيمي از الكتروفورز استفاده مي شود.
3-4-5-2-1 تهيه بافر TAE 50x
براي تهيه بافر TAE 50x از موارد زير استفاده مي بريم :
* Tris : 5/60 گرم
* EDTA 5/0 مولار : 25 ميلي ليتر
* اسيد استيك : 28/14 ميلي ليتر
* آب استريل : به مقداري كه حجم نهايي به 250 ميلي ليتر برسد.
حجم نهايي : 25 ميلي ليتر
نكته : براي اينكه بافر TAE 50x را به بافر TAE 1x مورد استفاده دربياوريم آن را در حجم مناسب رقيق مي كنيم.
3-4-5-2-2 تهيه ژل آگارز
براي جداسازي قطعات حاصل از هضم دوگانه از ژل آگارز Low استفاده مي كنيم. براي تهيه ي ژل 5/1 درصد آگارز ، 45/0 گرم آگارز را در 30 ميلي ليتر از بافر TAE 1x حل مي كنيم و با چرخاندن آرام ارلن به خوبي آن را مخلوط مي كنيم . به مدت مناسب به كمك يك گرماساز آن را حرارت مي دهيم تا كاملا ذوب شود. اين عمل تا آستانه جوشيدن ژل ادامه مي يابد. بايد دقت شود كه ژل به طور كامل حل شده باشد.
پس از اين كه محلول آگارز به طور نسبي تا دماي 50 تا 60 درجه سرد شود ، رنگ كرين ويوئر48 را به ميزان 2 ميكروليتر به آن اضافه مي كنيم و به ظرف مناسب شانه دار منتقل مي كنيم و بعد از مدت 15 دقيقه در دماي محيط ژل كاملا آماده است. اين ژل در حضور بافر TAE 1x تا يك هفته در دماي 4 درجه قابل نگه داري است.
3-4-5-2-3 Run كردن نمونه
پس از بسته شدن كامل ژل ، آن را درون تانك قرار مي دهيم به نحوي كه چاهك ها به سمت قطب منفي قرار گيرند. ميزان بافر TAE 1x دورن تانك الكتروفورز بايد به حدي باشد كه به طور كامل روي ژل را بپوشاند.
نمونه را به همراه (loading dye) در درون چاهك ريخته و از يك ماركر وزن مولكولي 1kb هم جهت شناسايي سايز قطعات در يكي از چاهك ها استفاده مي كنيم.
تانك الكتروفورز را به منبع توليد ولتاژ وصل كرده و با ولتاژ 120 ولت و 55 آمپر الكتروفورز را انجام مي دهيم.
وقتي رنگ تا حد.ود 3/2 ژل پيشرفت كرد تانك را از منبع نيرو جدا كرده و ژل را به كمك دستگاه مورد بررسي قرار مي دهيم.
3-5 ساب كلونينگ ژن CD166
جهت بيان ژل CD166 از باكتري E.coli BL21(DE3) استفاده شد. ابتدا ژن موردنظر از ژل اگارز مرحله الكتروفورز خالص سازي شد و سپس به كمك تكنيك Ligation با پلاسميد pet-28a تركيب شد. سپس اين تركيب به سلول هاي شايسته اي E.Coli BL21 ترانسفورم شد.
3-5-1 تلخيص DNACD166 از ژل
براي تلخيص از كيت استخراج DNA از ژل توليدي شركت فرمنتاز ليتواني استفاده شد. (شكل 3-9)
شكل 3-9. كيت استخراج DNA از ژل فرمنتاز
روش انجام آن بصورت زير مي باشد :
1- به كمك اين اسكالپل استريل ، ناحيه اي از ژل كه DNACD166 در آن قرار دارد را جدا كرده و به قطعات كوچك تقسيم مي كنيم تا زودتر در Binding Buffer حل شود.
2- به ژل حاوي DNA نوتركيب ، 400 ميكروليتر Binding Buffer در داخل يك ميكروتيوب اضافه مي كنيم.
3- مخلوط را به داخل بن ماري 55 درجه انتقال داده و به مدت 5 دقيقه انكوبه مي كنيم براي سهولت در ذوب شدن كامل ژل آن را هر 2 دقيقه هم مي زنيم.
4- 5 ميكروليتر سيليكا به مخلوط اضافه مي كنيم.
5- 5 دقيقه در بن ماري 55 درجه قرار مي دهيم تا سيليكا به خوبي حل شود.
6- به مدت 10 ثانيه ميكروتيوب را سانتريفيوژ كرده تا سيليكا رسوب كند. محلول رويي را دور مي ريزيم.
7- 5.. ميكروليتر Washing buffer به ميكروتيوب اضافه كرده و به كمك ورتكس به خوبي مخلوط مي كنيم.
8- به مدت 10 ثانيه ميكروتيوب را سانتريفيوژ كرده و محلول رويي را دور مي ريزيم.
9- مرحله ي 7 و 8 را دوبار ديگر تكرار مي كنيم تا تمام الكل موجود از مرحله ي قبل حذف شود (الكل ممكن است از واكنش هاي آنزيمي مراحل بعدي جلوگيري كند).
10- 30 ميكروليتر بافر TE به رسوب اضافه كرده و ورتكس مي كنيم تا كاملا با محتويات ميكروتيوب مخلوط شود.
11- ميكروتيوب را به مدت 5 دقيقه در 55 درجه قرار مي دهيم.
12- به مدت 1 دقيقه ميكروتيوب را در 15000 دور سانتريفيوژ كرده تا تمامي تركيبات جامد ته نشين شود. اينك محلول رويي حاوي DNA تلخيص شده است.
3-5-2 لايگيشن
براي اتصال DNACD166 استخراج شده از ژل با پلاسميد بياني pet-28a در آزمايشگاه از آنزيم ليگاز49 استفاده مي شود كه مي تواند اتصالات فسفودي استري شكسته شده را ترميم كند. اين آنزيم از فاز T4 استخراج شده است و انرژي لازم براي فعاليت خود را از ATP تامين مي كند و مي تواند هم انتهاهاي صاف و هم چسبنده را به هم متصل كند.
روش انجام اين عمل به شكل زير است :
1- محتويات واكنش را بصورت زير مخلوط مي كنيم.
* بافر لايگيشن 10x : 3 ميكروليتر
* آب استريل : 9 ميكروليتر
* DNA ليگاز T4 : 1 ميكروليتر
* پلاسميد pet-28a : 2 ميكروليتر
* Insert (DNACD166) : 15 ميكروليتر
حجم نهايي : 30 ميكروليتر
نكته : در آخرين مرحله آنزيم DNA ليگاز T4 اضافه شود.
2- به كمك دستگاه ترموسايكلر ميكروتيوب حاوي مخلوط واكنش را به مدت 4 ساعت در 16 درجه سانتيگراد سپس به مدت يك شب در دماي 4 درجه سانتيگراد انكوبه مي كنيم.
3-5-3 ترانسفورماسيون
بدين منظور از سويه E.coli BL21 كه يكي از رايج ترين سويه هاي كلونينگ است استفاده مي كنيم. اين باكتري به تنهايي حساس به كانامايسين است ولي وقتي وكتور pet-28a را جذب كند نسبت به آنتي بيوتيك مقاوم شده و بر روي آگار حاوي كانامايسين تشكيل كلوني مي دهد.
3-5-3-1 آماده سازي سلول هاي شايسته
1- باكتري در محيط كشت فاقد كانامايسين كشت داده شد.
2- پس از 24 ساعت نگهداري در انكوباتور ، يك تك كلوني را انتخاب كرده و به 5 ميلي ليتر محيط LB مايع بدون كانامايسين تلقيح مي كنيم و سپس به مدت يك شب تا صبح در شكيرانكوباتور قرار مي دهيم تا باكتري رشد كنند.
3- يك ميلي ليتر از محيط فوق را به 5 ميلي ليتر محيط LB تازه تلقيح نموده و مجددا در شكيرانكوباتور قرار مي دهيم. 2 تا 3 ساعت بعد محيط كدورت مناسب يعني جذب 5/0 تا 8/0 در 500 نانومتر را به

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید