قرمز باندbp4366 مربوط به پلاسميد حاوي ناحيهCD166 و پيکان ابي محل باند 3000bp لدر .
پس از اين كه وجود پلاسميد در محصول حاصل از استخراج پلاسميد كلوني هاي ترانسفورم شده با پلاسميد حاوي ژن سنتز شده CD166 تائيد شد ، به كمك تكنيك هضم دوگانه آنزيمي ، وجود ژن CD166 در پلاسميد ، با توجه به جايگاه هاي آنزيمي Ncol و Xhol قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسي قرار گرفت. دو باند دلخواه 1463 bp (CD166) و 2907 bp (پلاسميد pBSK) نمايان گشت كه تائيدي بر وجود ژن موردنظر در پلاسميد تكثير شده دارد.
شكل 4-9. نتيجه حاصل از هضم آنزيمي دوگانه پلاسميد تكثير يافته pBSK را نشان مي دهد.

شكل 4-9. هضم دوگانه آنزيمي پلاسميد تكثير يافته pBSK- از سمت راست چاهک اول نمونه هضم انزيمي پلاسميد حاوي ناحيه CD166 و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb -پيکان هاي قرمز از بالا پلاسميد (bp 2907) و ناحيه CD166 (bp 1558) -پيکان هاي ابي از بالا محل قرار گيري باند bp 3000 و 1500bp لدر.
4-4 ساب كلونينگ ژن CD166
جهت بيان ژن CD166 از باكتري E.coliBL21(DE3) استفاده شد. ابتدا ژن موردنظر از ژل آگارز مرحله الكتروفورز خالص سازي شد و سپس به كمك تكنيك Ligation با پلاسميد pet-28a تركيب شد. سپس اين تركيب به سلول هاي شايسته اي E.Coli BL21 ترانسفورم شد. در شكل 4-10 نقشه ژني پلاسميد pet-28a نشان داده شده است.

شكل 4-10. نقشه ژني پلاسميد pet-28a(www.smapgene.com)
اين باكتري به تنهايي حساس به كانامايسين است ولي وقتي وكتور pet-28a را جذب كند نسبت به آنتي بيوتيك مقاوم شده و بر روي آگار حاوي كانامايسين تشكيل كلوني مي دهد. در شكل 4-11 كلوني هاي رشد كرده بر روي محيط كشت حاوي آنتي بيوتيك كانامايسين بعد از ترانسفورماسيون باكتري BL21(DE3) با پلاسميد pet-28a حاوي ژن CD166 را نشان مي دهد.

شكل 4-11. باكتري هاي BL21(DE3) ترانسفورم شده با pet-28a حاوي ژن CD166- از سمت راست چاهک اول ، دوم و سوم نمونه حاوي پلاسمد Pet-28a حاوي ناحيه CD166 و چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1KB .پيکان قرمز باندbp 6957 مربوط به pet حاوي ناحيه CD166 و پيکان ابي محل باندbp 6000 لدر.
سپس از تك كلوني هاي رشد كرده استخراج پلاسميد به روش ليز قليايي صورت گرفت تا وجود پلاسميد حاوي ژن موردنظر تائيد شده و از طرفي وجود هر گونه آلودگي را از بين مي برد. براي تائيد وجود پلاسميد pet-28a در محصول استخراج پلاسميد ، الكتروفورز صورت گرفت و با تشكيل باند در 6832 bp ، اين ادعا تحقق يافت. در شكل 4-12 ، نتيجه الكتروفورز محصول استخراج پلاسميد pet-28a از سلول هاي ترانسفورم شده BL21(DE3) ، نشان داده شده است.
شكل 4-12. تائيد حضور پلاسميد pet-28a حاوي ژن CD166 در باكتري ترانسفورم شده BL21(DE3)
پس از اين كه وجود پلاسميد pet-28a در محصول حاصل از استخراج پلاسميد كلوني هاي ترانسفورم شده با پلاسميد حاوي ژن سنتز شده CD166 تائيد شد ، به كمك تكنيك هضم دوگانه آنزيمي ، وجود ژن CD166 در پلاسميد ، با توجه به جايگاه هاي آنزيمي Ncol و Xhol قرار داده شده در دو سر ژن سنتز شده مورد بررسي قرار گرفت. دو باند موردنظر 1463 bp (ژن CD1669 و 5369 bp (پلاسميد pet-28a) نمايان گشت كه تائيدي بر وجود ژن موردنظر در باكتري ترانسفورم شده است. شكل 4-13 ، نتيجه حاصل از هضم آنزيمي دوگانه پلاسميد pet-28a حاوي ژن CD166 را نشان مي دهد.

شكل 4-13. نتيجه حاصل از هضم آنزيمي دوگانه پلاسميد pet-28a حاوي ژن -CD166 چاهک اول از سمت چپ لدر DNA1kb و چاهک هاي دوم سوم و چهارم نمونه هضم انزيمي pet حاوي CD166 -پيکان هاي ابي از بالا باندهاي 6000 وbp 1500 لدر و پيکان هاي قرمز از بالا باند 5396 ((pet28 و هم چنين bp1500 CD166
4-5 بيان پروتئين CD166 و تائيد آن به كمك تكنيك SDS-page
پس از تائيد ترانسفورماسيون و وجود پلاسميد حاوي ژن CD166 در باكتري ميزبان ، با توجه به پروموتر lac در پلاسميد pet-28a ، جهت القاء بيان پروتئين در باكتري از القاگر IPTG در رقت مناسب استفاده شد. به منظور جداسازي باندهاي پروتئيني سلولي و ردگيري پروتئين نوتركيب در سلول هاي ترانسفورم شده و نيز ميزان بيان پروتئين موردنظر از الكتروفورز بر روي ژل پلي اكريل اميد استفاده شد و عصاره هاي سلولي تهيه شده بر روي SDS-page الكتروفورز شدند. پس از رنگ آميزي با كوماسي G-250 كلوئيدي ، باند 50/53 كيلو دالتون مربوط به پروتئين CD166 در نمونه ها ظاهر شد و علاوه بر اين در نمونه هاي كنترل منفي باندي در اين ناحيه مشاهده نشد. در شكل 4-14 ، الكتروفورز پروتئين CD166 بر روي SDS-page 15 درصد با رنگ آميزي كوماسي بلو نشان داده شده است.

شكل 4-14. بررسي بيان پروتئين CD166 به كمك تكنيك -SDS-page از سمت چپ چاهک اول ، ئوم و سوم نمونه کنترل مثبت حاوي پروتئين بيان شده CD166-چاهک چهارم نمونه منفي و چاهک اخر لدر پروتئيني-پيکان قرمز رنگ باند 55 کيلو دالتوني پروتئينCD166 و پيکان سبز باند 60 کيلو دالتوني لدر

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید