گيري ترکيبات فنلي و آنتي اکسيدان
3-7-1- اندازه‌گيري ترکيبات فنلي
3-7-1-1- مواد و وسايل لازم
گياه خشک شده، استون، فولين، سديم‌کربنات، اسپکتروفوتومتر، لوله آزمايش، سرنگ هميلتون،. کامپيوتر, دستگاه HPLC مدل AGILENT سري 1200، ارلن، کاغذ صافي، بالن ژوژه، آسياب برقي، روتاري مدل RV10basic ، ظروف مخصوص نگه داري عصاره تر و خشک، يخچال، ميکروتيوب، اسپاتول، سمپلر، سرسمپلر، ترازوي سه صفر و چهار صفر، ميکروپليت، ميکروپليت ريدر مدل ELx808شركت Biotek، پليت، پيپت، پوآر، سل کوارتز، ورتکس، فويل، بشر(شکل 3-4 ، 3-5، 3-6، 3-7).

شکل (3-4) دستگاه ميکروپليت‌ريدر
شکل3-5 وسايل مورد نياز آزمايش

شکل (3-6): استفاده از نرم‌افزار ويژه دستگاه ميکروپليت‌ريدر
شکل (3-7): دستگاه روتاري

3-7-1-2-اندازه گيري پلي فنل توسط دستگاه HPLC
3-7-1-2-الف مواد مورد نياز آزمايش
حلال متانول مرک، نمونه‌هاي خشک و پودر شده گياهي، استيک اسيد، گاليک اسيد، DPPH، کلروجنيک اسيد، سيناميک اسيد، کافئيک اسيد(شکل 3-8).

شکل (3-8): بخشي از مواد و وسايل بکار رفته در آزمايش

3-7-1-2-ب- تهيه عصاره‌هاي گياهي
پس از خشک کردن نمونه‌هاي گياهي در هر مرحله از آزمايش، نمونه‌ها توسط آسياب برقي آسياب (پودر) شد. ده گرم از اين نمونه‌هاي پودر شده درپنجاه ميلي‌ليتر، حلال متانول به مدت 48 ساعت خوابانده و با کاغذ صافي، عصاره‌گيري انجام شد. اين عصاره‌ها را در روتاري تغليظ و جهت اندازه گيري فنل كل، کاملاً خشک(بدون حلال) در ظروف مخصوص ريخته شد و دور آن را فويل آلومينيومي پيچيده و در يخچال نگهداري شد.

3-7-1-2-ج- غلظت سازي عصاره‌ها
ابتدا بايد عصاره گيري از طريق خوابانيدن در حلال متانول غليظ مرک انجام شود. پس از خشک‌کردن گياه در شرايط دماي اتاق يا آزمايشگاه و در سايه، گياه با استفاده از آسياب معمولي، پودر شده و مقدار 1 گرم پودر به 10 ميلي‌ليتر متانول اضافه شد و به همين ترتيب به نسبت 1 به 10 به مدت 24 ساعت قرار داده شد و سپس بعد از 24 ساعت از کاغذ صافي عبور داده شده و محلول زير صافي روتاري گرديد.(دماي روتاري بايد حدود 60 درجه يعني دماي جوش متانول باشد). در اين زمان چون به وسيله روتاري دما به دماي جوش متانول رسانيده شد، متانول تبخير شده و در ظرفي جداگانه وارد گرديد و آنچه باقي ماند عصاره خالص بود (تغليظ انجام شد و تا آن حدي که نياز داريم متانول تبخير مي‌شود) و اين بستگي به هدف ما در خصوص ميزان غلظت عصاره دارد که اگر بخواهيم کامل تغليظ شود متانول کامل تبخير مي‌شود.( تغليظ براي اين است که ماده موثره را استخراج کنيم).

3-7-1-3- اندازه گيري فنل کل فراسيون توسط روش Follin-Ciocalteu
براي اندازه گيري فنل کل در اين آزمايش از روش ابراهيم زاده و همکاران استفاده شد. در اين روش ابتدا 40 ميلي‌گرم عصاره خشک شده در 25 ميلي‌ليتر متانول مرک حل شد و 5/0 ميلي‌ليتر از اين عصاره متانولي را با 5 ميلي‌ليتر فولين سيوکالتيو (1 به 10 رقيق شود با آب مقطر) و 4 ميلي‌ليتر کربنات سديم يک مولار (6/10 گرم در 100 ميلي ليتر آب مقطر) و براي ساختن شاهد 5/0 ميلي‌ليتر متانول مرک را با 5 ميلي‌ليتر فولين سيوکالتيو (1 به 10 رقيق شود با آب مقطر) و با 4 ميلي‌ليتر کربنات سديم ترکيب شد و 15 دقيقه در تاريکي و با دستگاه اسپکتوفتومتر، طول موج 765 نانومتر خوانده شد و براي ساختن استاندارد گاليک اسيد از غلظت‌هاي 0، 50، 100، 150، 200، 250 ميلي‌گرم بر ليتر در متانول مرک استفاده شد و در برنامه آماري نمودار خطي رسم شد و معادله خط نيز به دست آمد. (y = 0.0063x, r2 = 0.987).
و جذب نمونه‌ها را به جاي Y گذاشته و X فنل کل است که بايستي آن را بدست آوريم و ما آن را براي براي 1 گرم در ليتر بايد حساب کنيم و واحد فنل کل mg gallic acid equivalent/g مي‌باشد(شکل 3-9).

شکل 3-9 مراحل اندازه گيري فنل

3-7-1-4- عصاره‌گيري پلي فنل‌ها
ابتدا گياه خشک شده را با آسياب برقي پودر کرده واز الک بسيار ريز رد کرديم. به اندازه 2/0گرم از آن را اندازه گيري و داخل ميکروتيوپ ريخته مي‌شود، سپس حلال 85/0 متانول + 15/0 اسيد استيک را با هم مخلوط کرده و به مقدار 10 برابر مقدار نمونه، روي نمونه گياه ريخته، که 2 سي سي مي‌شود. سپس داخل ميکروتيوپ را از گاز ازت پر کرده تا هوايي داخل آن نباشد چون اگر هوا باشد باعث اکسيده شدن ترکيبات مي‌شود.
سپس نمونه ها را داخل فويل پوشانده که نور نبيند، چون ترکيبات پلي فنلي به نور حساس اند. سپس به مدت 24 ساعت در يخچال نگه‌داري مي‌شود تا نمونه ها کاملاً با محلول بماند و خيس بخورد. بعد از 24 ساعت نمونه‌ها را از يخچال در آورده و همراه با فويل پوشيده شده در دستگاهUltrasonic cleaner قرار داده تا با ضربه‌هاي مغناطيسي که به گياه وارد کرده، ترکيبات پلي فنلي بهتر و بيش تر از بافت گياه جدا و وارد حلال شوند، محلول را به مدت 15 دقيقه در دماي کاملاًپايين در اين دستگاه قرار مي‌دهيم.
سپس نمونه‌ها را از اين دستگاه و از فويل خارج کرده در سانتريفيوژ يخچال دار با دماي 0 درجه و 10000 دور به مدت 20 دقيقه قرار داده تا فاز مايع از جامد جدا شود. نمونه‌ها را از دستگاه خارج کرده که ايجاد دو فاز کرده، فاز رويي را جدا کرده و دور ريختيم و روي بقيه را ان هگزان ريخته و روي ورتکس قرار داديم که کاملاً حل گردند، و دوباره به مدت 10 دقيقه و دماي 0 درجه و دور 10000 درون سانتريفيوژ يخچال دار قرار داديم که دوباره ايجاد دو فاز مي کند. فاز رويي کلروفيل + پروتئين + چربي بوده و فاز زيرين پلي فنل مي‌باشد.
سپس با سرنگ، پلي فنل زيرين را کشيده و به سر سرنگمان صافي سر سرنگي زده تا کاملاً نا خالصي‌ها گرفته شود سپس داخل شيشه‌هاي مخصوص HPLC ريخته، که آماده تزريق به دستگاه مي‌باشد.
3-7-2- اندازه گيري خاصيت آنتي اکسيداني
3-7-2-1- مواد و وسايل لازم
کوئرستين، گاليک اسيد، ويتامين E، پيپت، سرنگ هميلتون، پيپتور، لوله آزمايش، سِل، استون، آب مقطر، متانول
3-7-2-2- شرح کار:
ابتدا ميزان gr 25/. از ماده خشک از هر سه گياه (رويش يافته در مناطق استهبان، زرين دشت و نيريز) به طور جداگانه پودر کرده و داخل فالکون ريخته سپس ميزان cc 10 استون 80% اضافه مي‌شود. براي جلوگيري از نور، فالکون حاوي مواد را داخل فويل پيچيده و به مدت 1 ساعت در دماي محيط قرار داده و سپس نمونه‌ها به مدت 10دقيقه با سرعت 3500 دور در ثانيه سانتريفيوژ ‌شد.
پس از آن محلول گاليک اسيد، ويتامين E و کوئرستين با 11 غلظت و در مدت زمان مشخص به محلول اضافه شد.
شکل 3-10 اندازه گيري آنتي اکسيداني

براي اينکه از خطا جلوگيري شود اضافه کردن محلول استاندارد به لوله‌هاي آزمايش با يک فاصله زماني معين (2 دقيقه) انجام شد.
پس از ساخت نمونه‌ها و کاليبره کردن، طول موج نمونه‌ها با اسپکتروفوتومتر در طول موج 519 قرائت مي‌شود. سپس با تجزيه و تحليل آماري با استفاده از ميکروپليت ريدر ميزان آنتي اکسيداني ترکيبات بدست مي‌آيد (شکل 3-10).

فصل چهارم
نتايج

4-1- درصد اسانس شيره گياه مرتعي دارويي آنغوزه رويش يافته در سه منطقه استان فارس
عمل اسانس‌گيري براي هر نمونه 3 بار تکرار گرديد. مقادير بر اساس درصد وزني به وزني محاسبه شد و با عنوان درصد اسانس10 گزارش گرديد.
نتايج اين پژوهش نشان داد، که ميانگين درصد اسانس آنغوزه رويش يافته در منطقه استهبان(75/13%)، آنغوزه رويش يافته در منطقه زرين دشت(96/12%) آنغوزه رويش يافته در منطقه نيريز(10/7%) است. تفاوت ميانگين اسانس‌هاي اين سه گياه در سطح احتمال يک درصد معني‌دار شد، مقايسه درصد اسانس اين سه گياه در شکل 4-1 آمده است.

شکل 4-1- مقايسه درصد اسانس در گياه مرتعي-دارويي آنغوزه در سه منطقه مختلف رويشي استان فارس

4-2- تجزيه کمي و کيفي اسانس گياه مرتعي-دارويي آنغوزه در مناطق رويشي استهبان، زرين شت و نيريز
4-2-1- تجزيه کمي و کيفي اسانس گياه مرتعي-دارويي آنغوزه در منطقه رويشي استهبان
چهل وهفت ترکيب در اسانس آنغوزه در منطقه رويشي استهبان شناسايي شد که در مجموع 95/99%، اسانس را تشکيل دادند. پيک‌هاي شاخص در کروماتوگرام نشان دهنده ترکيبات عمده تشکيل دهنده اسانس مي‌باشند که به‌ترتيب عبارت‌اند از: Z 1-پروپنيل 1سيک بوتيل دي سولفيد (97/29%)، E 1-پروپنيل 1سيک بوتيل دي سولفيد (98/9%)، تبيس(1متيل متيو)پروپيل دي سولفيد (32/9%)، پ10-اپي جي اُديسمول(26/7%)، آلفاپينن (39/6%)، بتاپينن (05/6%) و بتا اُسيمن (31/5%) و E بتا اُسيمن (35/4%) تعيين شد و درصد اسانس براي آنغوزه رويش يافته در استهبان(75/13%) وزن خشک گياه به‌دست آمد. کروماتوگرام اسانس آنغوزه رويش يافته در استهبان در نمودار 4-1 و ترکيبات عمده آنغوزه رويش يافته در استهبان در جدول 4-1 و ترکيب‌هاي عمده اسانس آنغوزه رويش يافته در استهبان در شکل 4-2 نشان داده شده است.
نمودار 4-1- کروماتو گرام اسانس گياه آنغوزه در منطقه استهبان

شکل 4-2- ترکيب هاي عمده تشکيل دهنده اسانس گياه آنغوزه در منطقه استهبان

جدول 4-1- ترکيب‌هاي تشکيل دهنده اسانس گياه آنغوزه در منطقه استهبان
درصد ترکيبات
RIشاخص بازدارندگي
نام ترکيب

رديف
6.39
933
a-Pinene

1
0.04
946
Camphene

2
0.04
971
Sabinene

3
6.05
977
b-Pinene

4
0.8
989
Myrcene

5
0.01
1015
a-Terpinene

6
0.01
1022
p-Cymene

7
0.23
1026
Limonene

8
5.31
1036
(Z)-b-Ocimene

9
4.35
1046
(E)-b-Ocimene

10
0.01
1055
g-Terpinene

11
0.02
1086
Terpinolene

12
0.22
1105
Dipropyl disulfide

13
0.02
1111
endo-Fenchol

14
0.69
1126
allo-Ocimene

15
0.29
1139
neo allo-Ocimene

16
0.12
1143
trans-Verbenol

17
0.48
1161
1-propyl sec-butyl disulfide

18
29.97
1164
(Z)-1-propenyl sec-butyl disulfide

19
9.98
1178
(E)-1-propenyl sec-butyl disulfide

20
0.05
1189
a-Terpineol

21
0.04
1195
Myrtenol

22
0.3
1210
Bis(1-methyl propyl)disulfide

23
1.68
1247
Unknown

24
0.8
1261
Unknown

25
0.65
1297
trans-Pinocarvyl acetate

26
0.1
1392
b-Cubebene

27
0.15
1396
n-Tetradecane

28
0.21
1409
a-Cedrene

29
0.12
1416
(E)-Caryophyllene

30
9.32
1427
Bis(1-methyl thio) propyl disulfide

31
1.14
1440
Aromadendrene

32
0.67
1450
a-Humulene

33
0.52
1482
b-Selinene

34
2.96
1496
4-epi-cis-Dihydro agarofuran

35
0.58
1500
b-Dihydro agarofuran

36
0.32
1510
g-Cadinene

37
0.47
1520
d-Cadinene

38
0.12
1541
a- Agarofuran

39
0.25
1545
Elemol

40
1.62
1595
Guaiol

41
0.85
1603
5-epi-7-epi-a-Eudesmol

42
7.26
1618
10-epi-g-Eudesmol

43
0.31
1627
g-Eudesmol

44
1.34
1640
Agarospirol

45
1.27
1641
Unknown

46
1.82
1649
Valerianol

47
13.75

Oil yield (%w/w)

48
99.95

Total

4-2-2- تجزيه کمي و کيفي اسانس گياه آنغوزه در منطقه زرين دشت

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید